皖南事变中不幸牺牲。项英对华中战略地位的认识不够，对向北发展的自觉性不够，措施不够有力，对抗日民族统一战线中独立自主的原则坚持不够，对合法的手续、方式考虑多了，对自主的发展强调不够，结果使一些部队和地区受约束多，影响到活动和发展；特别是他对国民党顽固派的反共阴谋警惕不够，对中共中央关于新四军军部及皖南部队应迅速撤至江北指示的执行迟迟下不了决心，使转移丧失有利时机，加之在转移途中处置失当，因而对新四军在皖南事变中遭受的严重损失负有责任。

    1941年1月4日，皖南新四军军部直属部队等9000余人，在叶挺、项英率领下开始北移。1月6日，当部队到达皖南泾县茂林地区时，遭到国民党军7个师约8万人的突然袭击。　　新四军英勇抗击，激战7昼夜，终因众寡悬殊，弹尽粮绝，除新四军第一支队司令员兼政治委员傅秋涛等2000余人分散突围外，少数被俘，大部分壮烈牺牲。

    皖南事变中，军长叶挺下山与国民党军谈判被扣押，副军长项英、副参谋长周子昆突围后率军部10余人隐蔽于附近山区，当地濂坑村的群众基础好，项英他们在中共地下党员的带领下来到姜岳凡（又名姜德贵）家。姜岳凡是地下党员，能够充分信任。在姜岳凡家住了三天后，转移到了附近山上的蜜蜂洞。蜜蜂洞洞内比较狭小，只能睡4个人。于是，项英、周子昆、警卫员黄诚和副官刘厚总在里面睡，其余人在外面搭棚子住。3月14日下半夜，刘厚总下黑手枪击3人，将熟睡的项英枪杀，将黄诚击伤。附近的警卫员听到枪声后赶来查看，发现项英和周子昆遇害。因为曾遇到慌张下山的刘厚总，警卫员立即追击，但没有追上。随后，在老乡的帮助下，项英与周子昆的遗体被掩埋在附近。项英年仅43岁。

    刘厚总离去后，经过一番周折投奔到国民党太平县党部，随后被送到皖南行署。虽然刘厚总多次表明卖身投敌的心迹，但国民党并不信任他。1952年8月初，刘厚总这个可耻的叛徒在江西南昌被处决。

    然而在1941年皖南事变后，项英的功绩多被抹煞，甚至被扣上“大叛徒”等罪名和诬蔑不实之词，被说得一无是处。20世纪80年代初中央档案馆公开出版了有关皖南事变的电报，这些电报充分证明了当年把新四军在皖南事变中遭受损失的全部责任推到项英身上是不公正的，是“负有责任”，而不是全部责任或主要责任。项英遗骸于1955年6月19日移葬于南京雨花台烈士陵园；1990年，在武昌为项英立了铜像，镌有中华人民共和国国家主席杨尚昆题词：“项英同志浩气长存”。

    1995年10月，中共党史出版社出版了《项英传》，全面介绍了项英的斗争经历、功过所在、优秀品质，论证了对皖南事变中损失的责任都推给项英不公正，进而否定项英的业绩不实事求是，为重新评价项英提供了史实。

    1998年5月，经中共中央批准，解放军总政治部、中央党史研究室举行纪念项英诞辰100周年座谈会。

    2000年12月，中共中央批准在安徽泾县云岭新四军军部旧址竖立项英铜像。同年，经中央军委批准，由军事科学院组织编《项英军事文选》，中央党校出版社于2003年出版。这是项英军事实践、对毛泽东军事思想形成发展所作贡献的历史见证。

    项英主要著述有《三年来坚持的游击战争》、《南方三年游击战争经验对于当前抗战的教训》（1937）、《项英将军言论集》（1939）等。