1937年卢沟桥事变发生后，项英从国民党报纸上了解到事变爆发的真相后，立即撰写了《卢沟桥事变与抗日斗争高潮》一文，分析了卢沟桥事变的实质，指出我们的任务是力争抗日的前途，动员和领导最广大的群众来威逼南京政府实行对日宣战，反对一切和平妥协，为保卫祖国而奋斗。与此同时，赣粤边特委决定将红军游击队改为抗日义勇军，进行抗日武装宣传。7月底，项英、陈毅从一本香港出版的《新学识》杂志上有关介绍中国各党派的文章中，看到毛泽东1937年5月3日在中国共产党全国代表会议上所作报告摘要，了解到中共中央关于建立抗日民族统一战线的方针和策略。对此，项英、陈毅等如获至宝，高兴万分。他们认真研究和学习了这些指示。根据毛泽东报告中的精神，结合当前的形势，项英写了题为《中国新的革命阶段与党的路线》的文章，指出中国革命现在已发展到抗日民族统一战线与国共两党重新合作阶段，现阶段的主要敌人是日本帝国主义，中心任务是打倒日本帝国主义。文章还阐述了中共中央所提出的在统一战线中应遵循的保持我党的独立性、有批评自由、争取抗日战争的领导权等原则，游击队必须遵照中共中央路线争取合作抗日，在上述三个原则基础上与国民党谈判。同时强调指出，要吸取大革命失败的教训，不要重蹈陈独秀主义的复辙。这篇文章对于转变赣粤边游击区干部战士的思想，正确认识和坚持抗日民族统一战线起了重要的作用，是指导赣粤边游击区同国民党地方当局进行谈判的纲领性文件。

    组军驰骋在抗日前线。项英在抗日战争时期，作为中共中央东南局分局（后东南局）书记、中共中央军委新四军分会书记、新四军副军长兼政委等职，担负着领导新四军在大江南北开展敌后抗战的重任。

    抗日战争全面爆发后，在与中共中央失去联系的情况下，项英根据间接获得的毛泽东在中共全国代表会议上的报告摘要和《中国共产党为公布共全作宣言》的基本精神，为促进赣粤边地区和其他一些地区的国共合作，进行了不懈的努力，不仅直接领导了赣粤边地区红军游击队的谈判改编，而且指导了南方其他一些地区红军游击队的谈判改编。

    1937年8月8日，项英、陈毅以中共赣粤边特委和红军游击队的名义发表宣言，指出卢沟桥事变是日本侵占华北的既定步骤，为了保卫华北和中国就要实行全国抗战，反对和平妥协；国民党军要立即停止进攻红军游击队，准许抗日自由，采取最低限度安定民生的办法。8月20日，项英以中共赣粤边特委名义分别致函国民党江西省政府主席熊式辉、赣州专员马葆珩、国民党军第四十六师师长戴嗣夏以及大余、信丰、南康、南雄等县县长，要求立即合作抗日，以配合全国抗战之大计。随后，项英根据毛泽东在党的全国代表会议的报告精神，起草了与国民党地方当局谈判条件：要求国民党地方当局承认赣南共产党的合法和言论行动上的自由；释放政治犯；解散“铲共团”；红军游击队组成独立的抗日部队；保证部队的给养，保证游击区群众的利益等。

    此时，国民党地方当局和驻军，却借机在群众中散布红军游击队“投降了”的言论，并写信给游击队，要求游击队负责人下山“自新”，归顺国民党军队。一些地主豪绅也乘机大造谣言。对此，项英、陈毅和赣粤边特委给予了有力的回击，严厉斥责国民党地方当局破坏国共合作统一战线的行径，要求他们必须改变那种“剿匪”主义的偏见，实现合作抗日。同时在群众中进行国共合作宣传及解释工作。经过斗争，迫使国民党地方当局承认了红军游击队的合法地位。在陈毅到大余和赣州与大余县、江西省政府代表谈判达成协议后，项英到达赣州，会见了国民党江西第四行政区保安司令王有兰和第四十六师师长戴嗣夏，不久，国民党军和保安团从赣粤边游击区撤退了。

    为了解决南方其他游击区红军游击队的谈判改编问题，项英于9月24日前往南昌，与国民党江西省政府代表进行谈判。到达南昌后，他致电在南京的叶剑英并转毛泽东，从而恢复了中央分局与党中央的联系。在南昌，他看到了《中国共产党为公布国共合作宣言》和《告全党同志书》。项英根据中共中央文件精神与国民党江西省政府代表进行谈判，国民党江西省政府口头接受了如下条件：游击队改编为抗日义勇军；游击区老租老债废除；游击队集中时期一切费用由江西省政府负担；其余问题候国共两党中央决定，谈判初步达成协议。

    根据中共中央的指示，在中国国民革命军第八路军驻南京办事处的安排下，项英经武汉、西安，于11月7日到达延安。12月，项英参与中共中央关于新四军编组原则的确定后，到达武汉按照中共中央的意图和长江局的意见，代表中国共产党同国民党当局谈判。在坚持共产党对新四军的绝对领导、国民党不得插手干部配备的前提下，就新四军的编组达成协议。新四军军长叶挺，副军长项英（政委），参谋长张云逸，副参谋长周子昆，政治部主任袁国平，副主任邓子恢。

    1938年春，项英和陈毅等分赴各游击区，传达中共中央关于国共合作、共同抗战及部队整编的指示，动员红军游击队下山集中改编，开赴前线。仅用3个月的时间，就把分散在南方8省14个地区的红军游击队编成4个支队，共10300余人，分别在皖南、皖中集结，完成改编为新四军的历史使命。后来陈毅在谈到这段历史时指出：“项副军长以其历史地位在全党的威信，使南方八省游击队造成铁的力量。以后跟叶军长合作，使改编成功，这是本军成立的关键。”

    9月29日至11月6日，项英参加在延安召开的中共扩大的六届六中全会，在会上作了关于新四军工作的报告。

    12月，上海英文《大美晚报》记者贝尔墩在云岭（在今安徽泾县云岭镇）新四军军部采访时，谈他对项英的印象时说：“他有时跟活的《共产党宣言》一样和你谈话，过会又用中国式的殷勤款待你。”贝尔墩称项英是“新四军的灵魂”，认为“史沫特莱说项英是个铁人，我觉得很对。”

    完成组建新四军的任务后，项英随新四军军部进抵皖南不久，就建议派先遣支队去苏南敌后即日本侵略军占领区进行战略侦察，先遣队出动后，第一二四支队也相继出动，取得蒋家河口、韦岗等初战的胜利。同年11月，他根据中央指示，派张云逸参谋长赴江北、加强抗日斗争的领导。

    1939年，项英不仅参与了新四军“向南巩固、向东作战、向北发展”方针的制定，还认真组织贯彻。在皖中，组建了江北指挥部，组建第五支队，负责开辟皖东抗日根据地；先后派军部特务营、第四团第一营和第五团第三营赴江北，增强了江北部队的骨干力量。在苏南，成立了江南人民抗日义勇军指挥部，当“江抗”西撤后，立即派江南抗日义勇军第三路军副司令员何克希等东返主持，后又派新四军第三支队副司令员谭震林任“江抗”东路指挥部司令兼政治委员，命令六团和四团和新四军江北指挥部第一纵队（司令员管文蔚）各一部，从扬中北渡长江，为中共中央军委新四军分会副书记、第一支队司令员陈毅，及新四军先遣支队司令员粟裕随后率江南主力北渡开辟苏北作了准备。在皖南，进行了坚持抗战阵地的激烈斗争，取得了五次繁昌保卫战的胜利。

    1940年4月，项英在皖南指挥春季反“扫荡”，10月参与指挥秋季反“扫荡”，共歼日伪军3000余人，取得反“扫荡”的胜利。日伪军其实是两个概念，包括日军和伪军。日军就是日本侵略军，伪军是中国人，是那些汉奸组织的队伍，替日本人卖命，欺压中国人的。新四军在组建的前三年期间，就共歼日伪军9万余人，部队也发展到近10万人。在严酷的环境中，项英仍十分重视部队的教育训练和干部队伍建设，强调要做好政治思想工作，发扬艰苦奋斗的优良传统，举办教导总队，大力培养干部，努力提高军政素质。他的《新阶段中我们江南抗战的任务》、《一年来作战的经验与本军建军工作》等文章，是新四军建军和政治工作史上的重要文献。

    自新四军组建起，项英就十分重视东南地区中共的党务工作。他指导各地党组织，以抗战初期新四军在各地建立的办事处、通讯处作掩护联络失掉关系的党员，发展新党员，恢复和建立党的组织。新四军军部驻扎云岭期间，项英于1939年7月16日在云岭石头尖村主持召开了中共新四军第一次党代会。这次会议是新四军自1937年10月组建到1947年1月番号撤销的10年中，新四军召开的唯一的一次党代会。这是作为中共中央东南局书记、中央军委新四军分会书记的项英，在领导新四军工作中的一个特别重要的贡献。在项英的领导下，1940年底中共中央东南局管辖的党组织扩大到浙江、福建、皖南、苏南、赣东北等地，党员共约5万名。这些党组织和党员带领群众，为开展当地革命斗争做出了重要贡献。1941年4月30日。刘少奇在华中局讨论东南地区党的工作时。曾经指出：“东南党的工作，抗战以来一般说来是有很大成绩的。”