中央红军主力长征后,项英临危受命,担任中共中央苏区分局书记、中央军区司令员兼政委，率部策应红军主力突围转移。当时中央给项英及中央分局的任务是：牵制国民党军掩护中央红军主力转移，并划定瑞金、宁都、会昌、于都之间的三角地区是项英率领部队必须最后死守的阵地。忠于职守的项英送走中央机关的最后一支队伍后，面对是一个无法想象的局面。留给他的只有红军加上政府工作人员名义上的约三万人，而在这些人中有一万多人是需要别人来照顾和保护的伤病员。队伍中有一半多的人手中只有大刀和梭标，他们将迎战五十万国民党军队的进攻。在红军主力离开后的第三天，项英主持召开了中央分局会议。会上他下了两道命令：第一党中央和红军主力能否胜利进行战略转移，事关全党全国人民最根本的利益，每一个都必须以积极的行动配合。第二作为共产党员、革命军人都必须无条件地服从命令，不许任何人在党中央和主力红军还没有离开苏区前搞疏散。换句话说，所有的人都必须坚持到敌人的刺刀顶到胸口的最后一刻。项英要求机关工作人员正常对外办公，处理公务，以迷惑敌人，隐蔽红军主力的转移。直到一个月之后，国民党才弄清了红军主力已经转移了。当蒋介石知道本已陷入绝境的红军从包围圈中消失了之后，便开始用极其严酷的手段来围剿留守的红军，将苏区害割成无数个小块，构筑了大量的堡垒封锁线，开始了全面清剿。项英多次向中央报告情况，请求中央给予“详细指示”，明确行动方针。由于党中央忙于红军主力转移，致使3个月“无指示”、“无回电”。直到遵义会议后，中央才于1935年2月5日给项英及中央分局发来电报。遵照党中央的指示，项英指挥部队分9路突围，分散开展游击战争。项英直到将向党中央报告突围的电报发出，敌人已经临近的危急情况，才下令埋掉电台、烧掉密码，离开于都，向赣粤边突围。在突围战中，瞿秋白、贺昌、何叔衡等一批党和军队的领导人相继牺牲。游击队员不仅仅要面对难以忍受的寒冷和饥饿，还要面对国民党大军的天天“清剿”。
　　1935年4月上旬，项英组织召开了一次重要会议，史称“长岭会议”。会议决定在“依靠群众，坚持斗争，积蓄力量，创造条件，迎接新的革命高潮”的战略方针下，实行“化整为零，分兵游击”的计划。5月，国民党大军约50倍于游击队的兵力对赣粤边游击区进行全面“清剿”，要求三个月内“打死、饿死、困死”游击队员。游击队员只能在山林里住，敌人就采取“移民并村”和赶老百姓出山的“封坑”手段，企图断绝游击队和群众的联系，使游击队得不到粮食、盐和基本生活用品。此时的项英和游击队员们过着像野人一样的生活，他们只能与山中的动物为伴，吃野菜、摘野果、挖竹笋、甚至于烧马蜂窝吃。当什么也找不到的时候就只能是忍耐。陈毅在《赣南游击词》中这样写道：“天将午，饥肠响如鼓，粮食封锁已三月，囊中存米清可数，野菜和水煮。叹缺粮，三月肉不尝，夏吃杨梅冬剥笋，猎取野猪遍山忙，捉蛇二更长。”这就是当时游击队真实生活的生动写照。就在这样每天都生死未卜的环境中，项英还经常对身边的人说：“我们只要剩下一个人，也要顽强地坚持下去，共产党的旗帜不能倒，游击队的旗帜不能倒。”
　　项英领导游击队运用游击战术原则，在群山峻岭中与敌人周旋，英勇机智，九死一生，历经无数艰难险阻，进行了长达三年的艰苦卓绝的殊死斗争。正是他们的存在，使人们始终意识到共产党还在、红军还在。国民党原定的三个月结束清剿的任务，就这样由半年改为一年，最后改为无结束期的“长期清剿”。后来，中共中央政治局曾作出《对于南方游击区工作的决议》，充分肯定项英同志及南方各游击区同志“长期艰苦斗争精神与坚决为解放中国人民的意志，是全党的模范。”这个决议，是党中央给予项英和他的战友们最高的奖赏。美国记者埃德加•斯诺说过这样一句话：“项英是从坟墓里爬出来的铁人。”