1964年10月，第一颗原子弹爆炸成功后，周恩来宣布中国政府关于核武器问题的承诺和建议。12月至翌年1月，出席全国人大三届一次会议，在《政府工作报告》中完整提出“四个现代化”目标和“两步走”战略。再次被任命为国务院总理。

    1966年春，周恩来担任北方八省、市、区农业小组组长。3月、4月赴河北邢台地震灾区视察并指导华北抗旱。8月，出席中共八届十一中全会，会后实际主持中央日常工作。

    1966年9月，红卫兵“破四旧”、“大串连”，周恩来宣讲党的政策，保护党内外干部，坚持抓生产、抓业务。1967年1月，坚持不迁出中南海，反对揪斗党和国家领导人。2月，在不同场合强调应坚持党的领导、保护广大干部、保持军队稳定。8月，制止外交部“夺权”，果断处置王力、关锋、戚本禹（翌年1月）。 1968年夏，主持起草制止武斗文电。

    1969年4月，周恩来出席中共九大，当选为中央委员、政治局委员、常委。1970年，出席中共九届二中全会。林彪事件后，主持中央日常工作。

    1971年4月，周恩来会见应邀来华的美国乒乓球代表团。7月、10月，两次会见美国总统特使基辛格。1972年2月，同美国总统尼克松会谈，中美发表《联合公报》。1972年9月，同日本首相田中角荣会谈，中日发表《联合声明》。

    1973年3月，周恩来主持中央政治局会议，讨论通过恢复邓小平党的组织生活和国务院副总理职务决定。8月，出席中共十大，作《政治报告》，当选中央委员、中央政治局常委、副主席。

    1974年6月，周恩来离中南海住院治疗。10月，在四届人大筹备期间，支持邓小平与“四人帮”斗争。12月，抱病飞长沙同毛泽东商定四届人大人事安排问题。 1975年1月，出席四届人大一次会议，作《政府工作报告》，重申“四个现代化”目标。四届人大确定以周恩来、邓小平为核心的国务院领导班子。5月，根据毛泽东的意见，支持邓小平主持政治局会议批评“四人帮”。冬，嘱咐叶剑英等注意不使大权落入“四人帮”手中。

    在“文化大革命”极端复杂的特殊环境下，周恩来同志忍辱负重，苦撑危局，作出了常人难以想象的努力，全力维护党和国家正常工作的运转，全力维护党的团结统一，尽一切可能减少损失。他保护了一大批党的领导骨干、民主人士和知识分子，同江青反革命集团的阴谋进行了各种形式的斗争。他曾说：“我不下地狱，谁下地狱；我不入苦海，谁入苦海？”

    1976年1月8日，周恩来在北京逝世。群山肃立，江河挥泪，全国人民无比悲痛。著名作家魏巍有诗：“惊闻华夏失栋梁，举国老幼尽哀伤，松柏枝头花如雪，白玉栏杆泪万行。”真实的反映了当时的情况。

    新中国成立后，周恩来同志先后担任政务院总理、国务院总理长达26年，全面组织和实施社会主义各项建设事业，兢兢业业，殚精竭虑，在政治、经济、外交、国防、统战、科技、文化、教育、新闻、卫生、体育等各领域倾注了大量心血，作出了奠基性的贡献。

    周恩来强调经济建设工作在整个国家生活中“居于首要的地位”，一个国家如果经济上不能完全独立，政治上也就不能完全独立。他强调要正确处理各种关系，做到统筹全局、全面安排、综合平衡、协调发展；强调“我们的国家不仅要有经济建设，还要有政治建设和精神建设”，建设社会主义必须全面发展；强调一定要重视环境保护，不能因发展经济而牺牲环境，不要做对不起子孙后代的事。

    周恩来高度重视科学技术和知识分子在社会主义建设中的关键作用，强调实现现代化、把我国建设成为社会主义强国“关键在于实现科学技术的现代化”，“知识分子是社会主义建设事业取得胜利的不可缺少的重要力量”。他组织领导“两弹一星”大规模科技攻坚取得重大突破，极大提升了我国的综合国力和国际地位。

    周恩来高度重视发挥统一战线在社会主义革命和建设中的作用，经常倾听各民主党派和无党派爱国人士的意见，为坚持和完善中国共产党领导的多党合作和政治协商制度作出了重要贡献。他时时不忘祖国统一大业，为解决香港、澳门和台湾问题做了大量基础性、开拓性工作。他博大精深的外交思想、丰富多彩的外交实践、独具一格的外交艺术和外交风格，在国际社会为党和国家赢得了很高的声誉。

    周恩来参与领导了革命和建设时期党的各项重大工作，一贯注重把马克思主义基本原理同我国具体实际结合起来，认真总结正反两方面的经验，深入进行理论思考，积极探索符合我国国情的社会主义建设道路，在政治、经济、军事、外交、统一战线、文化教育和党的建设等领域都有理论建树，为毛泽东思想的形成和发展作出了重要贡献，也为后来改革开放时期我们党形成中国特色社会主义理论体系提供了重要思想材料。

    美国前总统尼克松评价周恩来说：“是的，他是一个伟人，本世纪罕见的伟人。我感到惋惜的是，他生活在巨大的阴影之中，他总是小心谨慎地让舞台的聚光灯照射在毛泽东身上。”